انواع الایزا

انواع روشهاي الايزا

بعد از مقدمه‌اي كه در قسمت قبل شرح داده شد به انواع روشهاي الايزا مي‌پردازيم.

 امروزه بر حسب اينكه :

الف) ماهيت آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي مورد سنجش چگونه است و چه هدف كلي از انجام تست الايزا داريم؟

ب) چه مواد و چه واكنشگرهايي در اختيار داريم و يا قادريم تهيه كنيم؟

روشهاي مختلفي از آزمونهاي الايزا طراحي شده و بوفور در كيت‌هاي تشخيص پاتوژنها و در آزمايشهاي تحقيقاتي مورد استفاده قرار مي‌گيرند. اين روشها در زير مورد بررسي قرار مي‌گيرند: (پليت ، كونژوگة مناسب  و مادة رنگي مطلوب به سهولت توسط شركت‌هاي تجاري فراهم است.

3-3-1  الايزاي مستقيم

3-3-1-1  الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌ژن

• مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن بر روي پليت‌ها

• مرحلة دوم: شستشو

• مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة چهارم: شستشو

• مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

• مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

توضيح: در اين نوع الايزا، آنتي‌ژني كه به ته پليت متصل مي‌شود مستقيما با كونژوگه وارد واكنش مي‌شود. اين نوع روش الايزا، فقط در موارد مشخص استفاده   مي‌ شود و آن موردي است كه مي‌ خواهيم بدانيم كه كونژوگه ما براي انجام واكنش مناسب هست يا خير. يعني در اينجا آنتي‌ ژن  معمولا IgG مي‌باشد. بنابراين راه اصلي سنجش واكنش يا عدم واكنش كونژوگه‌اي كه عليه يك آنتي‌بادي تهيه شده است ، اين روش مي‌باشد.

تيتر كونژوگه را نيز مي‌توان با استفاده از اين روش الايزا سنجيد. امروزه براي سنجيدن واكنش مونوكلونال آنتي‌بادي كونژوگه شده با يك آنزيم كه برعليه يك آنتي‌ژن خاص مي‌باشد از اين روش استفاده مي‌كنند.

3-3-1-2  الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌بادي

• مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي بادی بر روي پليت‌ها

• مرحلة دوم: شستشو

• مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة چهارم: شستشو

• مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

• مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

 

توضيح: اين نوع روش الايزا نيز فقط در موارد مشخصي استفاده مي‌شود. كلا آنتي‌ژن در موارد بسيار معدودي كونژوگه مي‌شود و استفاده از اين روش بستگي به نوع كار تحقيقاتي دارد.

3-3-2  الايزاي غير مستقيم

• مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن

• مرحلة دوم: شستشو

• مرحلة سوم: افزودن آنتي‌بادي (عليه آنتي‌ژن پوشش داده شده) و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة چهارم: شستشو

• مرحلة پنجم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي ثانوية همراه با آنزيم عليه آنتي‌بادي اوليه) و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة ششم: شستشو

• مرحلة هفتم: افزودن سيستم رنگي

• مرحلة هشتم: قرائت پليت با الايزاريدر

توضيج: اين روش بسيار رايج مي‌باشد و معمولا براي مشخص نمودن آنتي‌بادي عليه يك پاتوژن خاص يا عليه يك مادة خاص درون سرم از اين روش استفاده مي‌شود. "ويژگي" اندازه‌گيري بستگي به  خلوص آنتي‌ژني  متصل شده به پليت دارد. در اين روش سرم ما مي‌تواند حاوي آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن باشد (مثلا در افراد مبتلا به بيماري كه بدنشان عليه پروتئين‌هاي آنتی ژنی يک پاتوژن آنتي‌بادي ساخته است) و مي‌تواند آنتي‌بادي عليه آن آنتي‌ژن نداشته باشد (افراد سالم). در اين روش در مراحل اوليه و تنظيم تست الايزا، مي‌توان سرم را با رقت‌هاي مختلف اضافه كرد (سرم را مي‌توانيم با محلول رقيق كنندة سرم رقيق كنيم) و بهترين رقت را در تست‌هاي الايزاي موازي كه فقط رقت سرم آنها متفاوت است بدست آورد. اين روش در كيت‌هاي تجاري تشخيص بيماريها بوفور استفاده مي‌شود. با استفاده از اين روش تيتراسيون كونژوگه نيز انجام مي‌شود.

3-3-3  الايزاي ساندويچ

3-3-3-1  ساندويچ مستقيم

• مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

• مرحلة دوم: شستشو

• مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة چهارم: شستشو

• مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي كونژوگه شده با آنزيم و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة ششم: افزودن سيستم رنگي

• مرحلة هفتم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح: دو آنتي‌بادي كه در اين سيستم بكار مي‌روند مي‌توانند هر دو از يك گونه باشند و يا مي‌توانند از گونه‌هاي متفاوتي از موجودات بدست آيند. گاهي اوقات به آنتي‌ژني كه در اين سيستم بكار مي‌رود آنتي‌ژن تسخير شده يا به دام افتاده مي‌گويند. در اين روش استفاده از محلولهاي بلوكه كننده يا افزودن محلولهاي بلوكه كننده به محلول پوشش‌دهي و محلولهاي شستشو بسيار مهم است.

	شما چگونه فكر مي‌كنيد؟(8)
	چرا در روش فوق استفاده از محلولهاي بلوكه كننده اهميت زيادي دارد؟ اگر جواب سوال فوق را ميدانيد آنرا برای ما ارسال کنيد

نكتة مهم در اين روش آنست كه بايد بدانيم كه آنتي‌ژن ما حداقل دو محل اتصال به آنتي‌بادي داشته باشد تا بتواند به اين آنتي‌بادي‌ها متصل شود.

3-3-3-2  ساندويچ غير مستقيم

• مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

• مرحلة دوم: شستشو

• مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

• مرحلة چهارم: شستشو

• مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن

• مرحلة ششم: شستشو

• مرحلة هفتم: افزودن آنتي‌بادي سوم كونژوگه شده با آنزيم (عليه آنتي‌بادي دوم)

• مرحلة هشتم: شستشو

• مرحلة نهم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح: مشخص است كه آنتي‌بادي دوم  بايد از يك گونة متفاوت از موجودات تهيه شود.

 

چگونگی انجام آزمون الایزا

پايه اساسي آزمون الايزا براساس واكنش آنتي‌بادي با آنتي‌ژن مي‌باشد. در آزمون‌هاي الايزا يك آنتي‌بادي اختصاصي با يك آنتي‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از يك آنتي‌بادي اتصال يافته با يك آنزيم بعنوان سيستم نشانگر، آزمون ادامه يافته و درنهايت با افزودن سوبستراي آنزيم و تبديل سوبسترا به محصول كه يك مادة رنگي مي‌باشد آزمون الايزا به پايان مي‌رسد طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور يك آنتي‌بادي (و يا آنتي‌ژن) و نيز غلظت آن مي‌باشد توسط يك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت مي‌گردد.

بعنوان مثال در يكي از رايج‌ترين روشهاي الايزا ( روش غير مستقيم) كه براي شناسايي حضور و يا عدم  حضور آنتي‌بادي  برعليه يك آنتي‌ژن موردنظر بكار مي‌رود ابتدا يك آنتي‌ژن برروي سطح جامد پوشش داده  مي‌شود سپس نمونة مجهول كه حضور و يا عدم حضور آنتي‌بادي برعليه اين آنتي‌ژن درون آن مورد بررسي قرار مي‌گيرد بر روي اين سطح جامد پوشش داده شده با آنتي‌ژن, افزوده مي‌شود.

 پس از آن آنتي‌بادي ثانويه يا درحقيقت آنتي‌بادي برعليه اين آنتي‌بادي اوليه كه متصل به آنزيم نيز مي‌باشد افزوده مي‌شود و در نهايت سوبستراي آنزيم در اختيار آنزيم قرار داده مي‌شود و پس از گذشت مدت زمان لازم واكنش آنزيمي خاتمه داده شده و رنگ بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت مي‌شود.

3-2-1  مراحل يك آزمون الايزا

مراحل انجام يك آزمون الايزا به‌صورت زير مي‌باشد:

1)     جذب يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي به سطوح جامد پلاستيكي كه اصطلاحا پوشش‌دهي ناميده مي‌شود.

2)     افزودن نمونه‌هاي مورد آزمايش

3)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختياز قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

4)     جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو

5)     افزودن عوامل متصل شده با آنزيم

6)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

7)     جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو

8)     افزودن سوبستراي آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده‌ها

9)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

10) خاتمه دادن واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده‌ها و قرائت دانسيتة نوري بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر

شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:

3-2-2  فاز جامد

امروزه بيشتر از پليت‌هاي 96 خانه‌اي بعنوان فاز جامد استفاده مي‌شود. انواع انعطاف‌پذير و جداشدني از پلي‌وينيل كرايد و انواع سخت و محكم از پلي‌استيرن ساخته مي‌شوند. هم ‌اكنون شركت‌هاي معتبر و متعددي به‌ساخت انواع مختلف پليت‌هاي الايزا مشغول هستند دربعضي از انواع اين پليت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضي ديگر مقعر مي‌باشند.

 بعضي از پليت‌ها داراي خاصيت چسبندگي بالا بوده و بعضي داراي چسبندگي متوسط مي‌باشند. امروزه آزمايشهاي متعددي با موفقيت با هر كدام از اين نوع پليت‌ها انجام مي‌شود و نمي‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پليت برتري بر ديگر انواع پليت‌ها دارد. مي‌توان با انجام دو آزمايش الايزاي كاملا يكسان كه تنها در نوع پليت متفاوتند و بررسي نتايج تشخيص داد كه براي كدام نوع از آنتي‌ژن، كدام پليت بهتر است. بطور كلي پليت‌هايي كه انتهاي چاهك‌هاي آنها تخت مي‌باشد توصيه مي‌شود.

3-2-3 پوشش‌دهي

اين مرحله كه يكي از مهمترين مراحل آزمون الايزا مي‌باشد عبارتست از اتصال پروتئين آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي بر  روي پليت       ,درون چاهك‌ هاي يك پليت 96 خانه‌اي, كه عمدتا براساس واكنش‌ هاي آبگريز مابين ماتريكس پلاستيكي و پروتئين مي‌باشد.  بنابراين هر پروتئين يك ثابت اتصال متفاوتي با پليت‌ها دارد. اين واكنش بستگي به  بار خالص پروتئين ندارد.

 بنابراين افزودن هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت موجب بروز اين نواحي  هيدروفوب در پروتئين‌ها شده و واكنش مابين پليت و پروتئين را مستحكم‌ تر مي‌ نمايد، اين دناتوره نمودن جزيي  پروتئين‌ها توسط قراردادن پروتئين در معرض دترژنت‌هاي ملايم و مواد داراي pH پائين حاصل مي‌شود كه بعد از اين مجاورت مي‌توان با استفاده از يك روش دياليز مناسب، بافر پوشش‌دهي را با اين مواد دناتوره كننده تعويض نمود.

 عمل پوشش‌دهي به عوامل زير بستگي دارد.

الف) مدت زمان پوشش‌دهي

ب) دما

ج) غلظت پروتئين‌هايي كه بايد پوشش داده شوند.

د)‌ نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهي

هـ) ضريب انتشار مولكولهاي پروتئيني درون محلول پوشش‌دهي درون چاهك‌ها

عوامل فوق يكپارچه بوده و جداي از يكديگر نيستند. يكي از مهمترين موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئين براي اتصال مناسب به پليت مي‌باشد كه از طريق تيتراسيون پروتئين بدست مي‌آيد.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl يك راهنمايي خوبي براي بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئين‌ها جهت اتصال خوب به پليت مي‌باشد البته اين محدوده وابستگي به خلوص نسبي پروتئين موردنظر جهت پوشش‌دهي دارد بنابراين غلظت يك پروتئين جهت پوشش‌دهي وابسته به فعاليت آن پروتئين مي‌باشد مشخص است كه يك محلول پروتئيني كه داراي مقدار كمي از پروتئين موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئين به پليت برطبق نسبت حضور آن پروتئين در محلول كم مي‌باشد و ناخالصي‌هاي موجود در محلول پروتئيني سطوحي را كه بايد پروتئين موردنظر ما در اختيار داشته باشد اشغال مي‌نمايند كه در نهايت منجر به يك اندازه‌گيري ضعيف مي‌شود.

 با استفاده از چند تست الايزا كه در آنها غلظت پروتئين موردنظر براي پوشش‌دهي متفاوت است مي‌توان به يك غلظت مناسب از پروتئين جهت پوشش دادن دست يافت. توجه به اين مطلب مهم است كه دانسيتة اتصال پروتئين به پليت درنتيجة نهايي بسيار مهم است. اتصال با دانسيتة بالا حتي ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتايج ضعيف منجر شود چرا كه اين دانسيتة بالا مي‌تواند از لحاظ قضايي اجازة نزديك شدن پروتئين دوم (آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي) را به پروتئين پوشش داده شده ندهد. درحقيقت مولكولهاي پروتئين پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالايي (و بينابين يكديگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتي جايگاه‌هاي اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئين دوم (فرضا آنتي‌بادي) نمي‌باشد.

 غلظت‌هاي بالاي پروتئيني كه بايد پوشش داده شود نيز منجر به‌همين مسئله مي‌شود.  رابطه غلظت يك آنتي‌ژن يا  آنتي‌بادي با چگالي نوري (OD) بدست آمده در مرحلة نهايي تست الايزا يك رابطة خطي صرف نمي‌باشد و براي هر پروتئيني بسته به فرم فضايي آن پروتئين و نيز در هر محدوده‌اي از غلظت‌هاي مختلف آن پروتئين متفاوت مي‌باشد.

ميزان هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين – پليت وابسته به دما نيز مي‌باشد افزايش دما موجب افزايش اين  هيدروفوبيسته مي‌شود  و دانستيم كه اين افزايش منجر به اتصال مستحكم‌ تر پروتئين به پليت مي‌ شود يكي از   رايج‌ترين روش‌هاي پوشش‌دهي از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پليت با پروتئين در دماي 37°c مي‌ باشد  كه در اين دما بين 1 تا 3 ساعت زمان مناسبي براي اغلب پروتئين‌  ها مي‌باشد در مرتبة بعد مي‌توان روش  پوشش‌دهي در طول شب در 4°c و يا تركيبي از ايندو را بكار گرفت.

بسته به ماهيت پروتئين‌ها، گاهي اوقات پوشش‌دهي در دماي آزمايشگاه با مدت زمان طولاني‌تر موردنظر قرار مي‌گيرد.

البته مشخص است كه افزايش دما در مدت زمان طولاني ممكن است باعث تغييراتي در ساختار پروتئين موردنظر جهت اتصال به پليت شود. تكان دادن يكنواخت، آرام و منظم پليت نيز مي‌تواند با افزايش ميزان برخورد و درنتيجه اتصال پروتئين به پليت، زمان موردنظر براي پوشش‌دهي را كاهش دهد.

3-2-3-1  بافر پوشش‌دهي

بيشترين بافرهايي كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار مي‌گيرند عبارتند از :

• بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50  ميلی مولار،

•  Tris – Hcl   بيست ميلی مولار با pH = 8/5 و يا

•  PBS   10 ميلی مولار با pH = 7/2

 اغلب روش‌هاي الايزا از يكي از اين سه نوع بافر استفاده مي‌نمايند.

 بافرهايي غير از موارد فوق هنگامي مورد استفاده قرار مي‌گيرند كه مشكلي در پوشش‌دهي با بافرهاي فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوري بهترين بافري كه مورد  استفاده قرار مي‌ گيرد بافري است كه داراي pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئين اتصالي باشد. اما درعمل اندازه‌گيري اين مطلب آسان نمي‌باشد چراكه پروتئين اتصالي (فرضا آنتي‌ژن) حاوي مخلوطي از پپتيدهاي متفاوت مي‌باشد. با انجام چند آزمايش الايزا كه pH‌هاي متفاوت و قدرت يوني متفاوتي در بافر پوشش‌دهي داشته باشد مي‌توانيم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئين به پليت را بدست آوريم.

پروتئين‌ هاي با خاصيت اسيدي، احتياج به يك pH پائين‌ تر جهت خنثي نمودن نيروي دافعه مابين پروتئين و پليت دارند و در آزمايشي جهت پوشش دادن پروتئين‌ هاي ويروس Herpes simplex كه خاصيت اسيدي دارند بهترين pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

در روش‌ هاي رايج امروزي پوشش دادن با بافر PBS يا كربنات اغلب موفقيت‌آميز است.

گاهي اوقات بعضي از آنتي‌ژن‌ها مشكلاتي را در پوشش‌دهي بوجود مي‌آورند اين آنتي‌ژن‌ها شامل پلي‌ساكاريدها ليپوپلي‌ساكاريدها و گليكوليپيدها هستند كه پوشش‌دهي مستقيم را منجر به نتايج ضعيف و نامناسب مي‌نمايند در اينگونه موارد يك پوشش‌دهي ابتدايي موردنياز است كه با يك آنتي‌سرم اختصاصي انجام مي‌شود كه يك حالت ساندويچي را بوجود مي‌آورد كه در ادامة همين فصل توضيح داده خواهد شد.

بنابراين مخلوط تخليص نشده آنتي‌ژن‌ها مناسب براي پوشش‌دهي مستقيم نمي‌باشد و درصورت نياز از الايزاي ساندويچي استفاده مي‌شود.

بدليل ماهيت غير كووالانسي اتصالي پروتئين به پليت، جداشدن يك پروتئين از پليت نيز ممكن است رخ دهد اما اگر شرايط پايدار و استاندارد باشد اين مطلب تأثير مهمي در يك آزمون الايزا نخواهد گذاشت.

 

	شما چگونه فكر مي كنيد؟(4)
	ميزان تخليص يك پروتئين چه رابطه‌اي با اتصال پروتئين به پليت دارد؟  اگر جواب سوال فوق را ميدانيد آنرا برای ما ارسال کنيد

الایزا

امروزه الايزا[1] بعنوان يكي از قدرتمندترين روشهاي آزمايشگاهي – تحقيقاتي در جهان مطرح مي‌باشد.  همانگونه كه خواهيم ديد اين روش از حساسيت[2] و اختصاصيت[3]  بسيار بالايي برخوردار است تا بدانجا كه هم‌ اكنون روش اصلي در زمينه‌ هاي مختلف علوم حياتي از شناسايي و تشخيص ويروسها، باكتري‌ها و انگل‌هاي پروتوزوا و متازوآ[4] گرفته تا شناسايي مقادير بسيار كم هورمونها و مولكولهاي حياتي در پزشكي باليني و آزمونهاي تحقيقاتي مي‌باشد .

 علاوه براين از سال 1971 كه اولين آزمونهاي مبتني بر آنزيم‌هاي متصل به آنتي‌بادي توسط پرلمان و انگوال[5] شرح داده شد صدها روش كارآمد براساس اصول اولية الايزا براي شناسايي تعداد بسيار زيادي از ماكرومولكولهاي بيولوژيك طراحي و با موفقيت اجرا شده است. امروزه بسياري از كيت‌هاي تشخيص بيماريها براساس روش الايزا بنا شده‌اند و سود شركت‌هاي بزرگ و معتبر تشخيصي، از محصولات مبتني بر روش الايزا به ميليون‌ها دلار مي‌رسد.

 در اين فصل به شرح دقيق مراحل مختلف انجام يك آزمون الايزا خواهيم پرداخت قبل از ورود به مباحث اصلي يك نوع الايزاي ساده والبته بسيار رايج بصورت مختصر شرح داده خواهد شد تا فراگير قادر باشد يك دورنماي كلي از روش الايزا در ذهن خود ترسيم كند سپس در ادامة فصل پس از توضيحات اصلي به انواع روشهاي الايزا بصورت دقيق و گسترده خواهيم پرداخت.

 پيش از آغاز اين فصل علامت‌هاي اختصاري رايج را كه بطور گسترده مورد استفاده قرار خواهيم داد مرور مي‌نمائيم.

آنتي‌ژن = Ag

آنتي‌بادي = Ab

آنتي‌بادي اوليه = Ab1

آنتي‌بادي ثانويه = Ab2

آنزيم = E

آنزيم متصل شده به آنتي‌بادي = آنتي‌بادي متصل شده به آنزيم = *E = *Ab

آنتي‌بادي عليه آنتي‌بادي ديگر = Anti – Ab

سوبستراي آنزيم = S

سنجش رنگ بدست آمده با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر = Read

فاز جامد = I