مطالعه میکروسکوپی قارچ ها

فهرست مطالب

 

روش جستجو و شمارش قارچها ( كپك‏ها و مخمرها ) به روش شمارش پرگنه

هدف و دامنه كاربرد

تعريف

اساس آزمايش

محيط كشت و محلولهاي مورد نياز

دستگاهها و وسايل لازم

روش كار

روش‏هاي مطالعه ميكروسكوپي

 

  

  روش جستجو و شمارش قارچها ( كپك‏ها و مخمرها ) به روش شمارش پرگنه

 در 25 درجه سلسيوس

  1- هدف و دامنه كاربرد

 هدف از تدوين اين استاندارد ارائه روش كلي براي شمارش کپك‏ها و مخمرها در موادغذايي به روش شمارش پرگنه در 25 درجه سلسيوس ميباشد .

  2- تعريف

 در اين استاندارد منظور از كپك و مخمر ميكرو اورگانيسم‏هايي هستند كه در دماي 25 درجه سلسيوس بر روي محيط بند (4-2-1) پرگنه مشخص توليد ميكنند .

  3- اساس آزمايش

 3-1- حجم مشخصي از نمونه مورد آزمون در صورت مايع بودن يا حجم مشخصي از سوسپانسيون اوليه در مورد فرآورده‏هاي ديگر و محيط كشت انتخابي به پليت اضافه ميگردد .

 3-2- پليت‏ها مدت 3 , 4 يا 5 روز در شرايط هوازي و 25 درجه سلسيوس نگهداري ميشوند .

 3-3- پرگنه‏هاي كپك و مخمر مورد بررسي و شمارش قرار ميگيرند و تعداد آنها در يك گرم يا يك ميلي ليتر از نمونه گزارش ميشود .

  4- محيط كشت و محلولهاي مورد نياز

 4-1- به منظور حصول نتايج بهتر استفاده از محيط تجارتي توصيه ميگردد كه بايستي طبق دستور سازنده عمل شود .

 كليه مواد شيميايي كه در آزمايش بكار ميروند بايد از خلوص كامل برخوردار باشند . آب مورد استفاده نيز بايستي آب مقطر و عاري از هرگونه مواد بازدارنده براي رشد كپك‏ها و مخمرها باشد .

 در مواردي كه محيط كشت و محلول رقيق كننده بلافاصله مورد استفاده قرار نميگيرند بشرطي كه تغييري در تركيبشان ايجاد نگردد تا يك ماه در تاريكي و صفر تا پنج درجه سلسيوس قابل نگهداري ميباشد .

 4-2- محيطهاي كشت و محلولهاي موردنياز

 4-2-1- محيط كشت عصاره مخمر - دكستروز - كلرامفنيكل آگار

Yeast extract- dextrose- chloramphenicol- agar

 

تركيب :
نام مواد	مقدار
عصاره مخمر	5 گرم	Yeast extract
دكستروز	20 گرم	Dextrose (C6H12O6)
كلرامفنيكل	0/1 گرم ^1	Chloramphenicol (C11H12Cl2N2O5)
آگار	15 گرم	Agar
آب مقطر	1 ليتر	Distilled Water

 

 روش تهيه

 تركيبات فوق را با جوشانيدن در آب حل نموده و سپس در ظروف مناسب تقسيم و در اتووكلاو 121 درجه سلسيوس به مدت 15 دقيقه سترون نمائيد . pH نهايي محيط بايستي 6/6 باشد .

 گاهي ممكن است اكسي‏تتراسيكلين به جاي كلرامفنيكل استفاده شود كه در اين صورت محيط بايه را به روش فوق تهيه و كلرامفنيكل را حذف كنيد . محيط را در مقادير 100 ميلي ليتري تقسيم و سترون نمائيد . سپس محلول 0/1 درصد از اكسي‏تتراسيكلين هيدروكلرايد² در آب تهيه و توسط صافي سترون نموده و در هنگام آزمايش 10 ميلي ليتر از محلول را به 100 ميلي ليتر از محيط كشت ذوب شده كه دماي , آن در حدود 45 درجه سلسيوس است اضافه نمائيد .

 در صورتيكه محيط تجارتي در دسترس است طبق دستور سازنده عمل نمائيد .

 4-2-2- محلول‏هاي رقيق كننده

 محلوهاي رقيق كننده را طبق استاندارد شماره 356 ملي ايران ( آماده كردن نمونه‏هاي موادغذايي و شمارش ميكرو ارگانيسم‏هاي مختلف ) تهيه نمائيد .

 4-2-3- محلول رنگ‏آميزي لاكتوفنل كاتن بلو Lactio phenol cott on blue

 

تركيب :
نام مواد	مقدار
فنل	20 گرم	Phenol
اسيد لاكتيك	20 گرم	Lactic acid
گليسرين	40 گرم	Glycerine
پودر كاتن بلو	50 ميلي گرم	Cotten blue powder
آب مقطر	20 ميلي ليتر	Distilled water

 

 روش تهيه :

 ابتدا فنل را به آب مقطر اضافه نموده , حرارت دهيد تا كاملا حل شود سپس اسيدلاكتيك و گليسرين را به آن بيافزائيد و پس از تهيه محلول لاكتوفنل , پودر كاتن بلو را به آن اضافه نموده و به آرامي به هم بزنيد .

  5- دستگاهها و وسايل لازم

 از دستگاهها و وسايل معمول در آزمايشگاه ميكروبيولوژي استفاده كنيد .

 

 

  6- روش كار

 6-1???- به اندازه 100-90 ميلي متري برداريد و بطور جداگانه به هر يك از پليت‏ها يك ميلي ليتر از نمونه مورد آزمون , در صورت مايع بودن و يا يك ميلي ليتر از سوسپانسيون اوليه را در مورد فرآورده‏هاي غيرمايع اضافه نمائيد .

 6-2- در صورت لزوم همين عمل را براي رقت‏هاي 0/1 و 0/01 تكرار كنيد

 6-3- سپس 15 ميلي ليتر از محيط كشت عصاره مخمر - دكستروز - كلرامفنيكل آگار ذوب شده كه دماي آن در حدود 45 درجه سلسيوس ميباشد را به هر يك از پليت‏ها اضافه و به آرامي آنها را مخلوط نمائيد . توجه داشته باشيد كه فاصله زماني بين تهيه رقت و اضافه نمودن محيط كشت به پليت‏ها از 15 دقيقه تجاوز ننمايد .

 پس از مخلوط شدن نمونه مورد آزمون و محيط كشت , تا جامد شدن محيط پليت‏ها را بر روي سطح صاف و خنك قرار دهيد , سپس آنها را مدت 3 الي 5 روز در 25 درجه سلسيوس نگهداري نمائيد .

 6-4- تفسير نتايج

 پرگنه‏ها را بعد از 3,4,5 روز بررسي نموده و نتيجه را پس از 5 روز در پليت‏هايي كه كمتر از 150 پرگنه دارند شمارش و گزارش كنيد .

 در صورتيكه بعضي از قسمتهاي پليت با رشد بيش از حد كپك‏ها پوشانده شده است و شمارش پرگنه‏هاي مجزا مشكل ميباشد , پرگنه‏هاي شمارش شده در روزهاي سوم يا چهارم را گزارش نمائيد .

 در صورت لزوم به منظور تشخيص مخمرها از باكتريها آنها را در زير ميكروسكوپ بررسي كنيد .

 

 

 

 

  7- روش‏هاي مطالعه ميكروسكوپي

 ساختمان قارچهاي كپكي

 7-1- روش خرد كردن پرگنه Teased mount

 توسط سوزن سركج پلاتيني قسمت كوچكي از پرگنه قارچ را برداشته و بر روي لام حاوي يك قطره محلول لاكتوفنل كاتن بلو قرار داده و با لامل سطح آن را بپوشانيد .

 سپس رنگ اضافي را خارج نموده و در زير ميكروسكوپ با عدسي با بزرگنمايي 10 و در صورت لزوم با عدسي با بزرگنمايي 40 قارچ را مورد بررسي قرار دهيد . با توجه به اينكه در روش خرد كردن پرگنه اغلب , ساختمان‏هاي قارچ و ارتباط آن از بين مي‏رود , براي مطالعه ساختمان قارچها بطور كامل از روش‏هاي مختلف اسلايدكالچر استفاده ميشود .

 7-2- روش اسلايد كالچر Slide culture

 7-2-1- وسايل لازم :

 پليت , لوله خميده U شكل , لام , لامل , پنس , بيستوري , محلول لاكتوفنل كاتن بلو , محيط كشت بند (4-2-1)

 7-2-2- روش كار :

 15 ميلي ليتر از محيط كشت بند (4-2-1) را درون بليت سترون ريخته و پس از جامد شدن توسط بيستوري سترون آن را به قطعات چهارگوش 1*1 سانتي‏متري تقسيم نمائيد . 7 الي 8 ميلي ليتر آب مقطر سترون به پليت حاوي لوله U شكل كه لامي برروي آن قرار داده شده و از قبل سترون شده است اضافه نمائيد تا رطوبت لازم جهت رشد قارچ تامين گردد . يك قطعه از محيط كشت چهار گوشه بريده شده را در شرايط ستروني بر روي لام درون پليت قرار دهيد و وسط چهار ضلع محيط كشت را با تكه‏هاي كوچك پرگنه قارچ موردنظر تلقيح نمائيد , سپس يك لامل سترون را بر روي محيط كشت تلقيح شده قرار داده , درب پليت را گذاشته و آن را در دماي 25 درجه سلسيوس نگهداري نمائيد , كشت را مرتبأ از نظر رشد , كونيدي زايي و رطوبت موجود در پليت مورد بررسي و كنترل قرار دهيد و پس از اطمينان از تشكيل ساختمان آن براي مطالعه ميكروسكوپي دو نمونه بطريق زير تهيه نمائيد :

 7-2-2- نمونه تهيه شده از لامل

 توسط پنس لاملي را كه در اطراف آن قارچ رشد نموده به آرامي از سطح محيط برداشته و بر روي يك لام تميز حاوي يك قطره لاكتوفنل كاتن بلو قرار دهيد . اگر قارچ در اطراف لامل نيز رشد كرده , يك قطره ديگر از لاكتوفنل كاتن بلو بر روي لامل ريخته و با لامل بزرگتري آن را بپوشانيد .

 7-2-2-2- نمونه تهيه شده از لام

 محيط كشت را از سطح لام برداريد و داخل پليت بگذاريد , سپس لام را از پليت خارج كرده و يك قطره لاكتوفنل كاتن بلو را در محل رشد پرگنه قارچ اضافه نموده و لاملي را بر روي آن قرار دهيد . در صورت وجود رنگ اضافي در خارج لامل توسط كاغذ خشك كن آن را خشك و براي مسدود نمودن اطراف لامل از لاك ناخن و يا هر ماده مشابه ديگري استفاده نمائيد و سپس لامهاي مزبور را در زير ميكروسكوپ بررسي كنيد .

 

1-غلظت نهايي بايستي 100 ميكروگرم در هر ميلي ليتر محيط كشت باشد .

2-Oxytetracycline hydrochloride

 کاندیدا آلبیکنس

آسپرژیلوس فومیگاتوس

پنی سیلیوم